NGS, Высокопроизводительное секвенирование, Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В., 2020

NGS, Высокопроизводительное секвенирование, Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В., 2020.
      
   Рассмотрены различные варианты и особенности современных методов определения структуры нуклеиновых кислот (методов секвенирования второго и третьего поколений). Описаны принципы наиболее популярных технологий высокопроизводительного секвенирования (NGS). Дана классификация высокопроизводительных методов секвенирования по нескольким параметрам. Приведены основные элементы первичного анализа данных масштабного секвенирования. Отдельные главы посвящены применению NGS для решения различных биологических задач: секвенирования прокариотических и эукариотических геномов и транскриптомов, метагеномного секвенирования, а также использованию NGS в медицинской практике.
Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии и биотехнологии.




Секвенирование при помощи электронного микроскопа.
Использование электронного микроскопа для определения последовательности нуклеиновых кислот было предложено Ричардом Фейнманом еще в конце 50-х годов XX века [18]. Электронная микроскопия включает в себя три технологических разновидности: сканирующая электронная микроскопия (СЭМ, SEM), просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ, ТЕМ) и сканирующая просвечивающая электронная микроскопия (СПЭМ, STEM).

В 1960-х и 70-х годах методы просвечивающей электронной микроскопии активно разрабатывались, тогда же были предложены подходы для определения последовательности ДНК [19, 20]. В 1970 году Альберт Крю предложил метод визуализации в сканирующем электронном микроскопе (high-angle annular dark-field imaging, HAADF). Используя эту технику, можно обнаружить отдельные тяжелые атомы на тонких пленках аморфного углерода [21]. Чтобы визуализировать отдельные основания в ДНК, они должны быть помечены атомами тяжелых металлов. Однако метод не был доведен до практического использования из-за быстрого разрушения молекулы ДНК пучком электронов.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ПРЕДИСЛОВИЕ Е. Д. СВЕРДЛОВА.
ПРЕДИСЛОВИЕ М. С. ГЕЛЬФАНДА.
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРОВ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОМПАНИЙ, УПОМЯНУТЫХ В ТЕКСТЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ГЛАВА 1. Обзор методов определения последовательности нуклеиновых кислот.
1.1. Методы, основанные на детекции сигнала от множества одинаковых молекул ДНК (методы с предварительной амплификацией фрагментов ДНК).
1.2. Методы, основанные на детекции сигнала от одной молекулы ДНК (секвенирование одиночных молекул ДНК).
1.3. Другие методы секвенирования.
Список литературы.
ГЛАВА 2. Технологии создания библиотек фрагментов ДНК для NGS.
2.1. Очистка нуклеиновых кислот для NGS.
2.2. Оценка концентрации нуклеиновых кислот и полногеномная амплификация (WGA).
2.3. Способы разрушения ДНК для приготовления библиотеки.
2.4. Оценка длин фрагментов ДНК.
2.5. Присоединение адаптеров.
2.6. Предварительная амплификация библиотеки.
2.7. Отбор фракции фрагментов нужной длины (size-select).
2.8. Мечение смешиваемых образцов специфичными адаптерами («штрих-кодирование»).
2.9. Клональная амплификация фрагментов ДНК.
2.10. Типы библиотек фрагментов ДНК для NGS.
Список литературы.
ГЛАВА 3. Коммерческие технологии высокопроизводительного секвенирования.
3.1. Технология 454 Life Sciences компании Roche (эмульсионная ПЦР + пиросеквенирование).
3.2. Технология SOLiD компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР + секвенирование лигированием).
3.3. Illumina Genome Analyser компании Illumina (мостиковая ПЦР + секвенирование синтезом).
3.4. Платформы Ion PGM и Ion Proton компании Life Technologies Thermo Fisher Scientific (эмульсионная ПЦР + полупроводниковое секвенирование).
3.5. Платформа PacBio компании Pacific Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул).
3.6. Платформа Heliscope компании Helicos Biosciences (секвенирование синтезом одиночных молекул).
Список литературы.
ГЛАВА 4. Общие принципы обработки данных NGS.
4.1. Оценка качества первичных данных.
4.2. Сборка геномов de novo.
4.3. Алгоритмы сборки.
4.4. Аппаратные и биологические особенности данных NGS.
4.5. Объединение контигов в скэффолды.
4.6. Вариации в близкородственных геномах.
4.7. Картирование прочтений при повторном секвенировании.
4.8. Поиск однонуклеотидного полиморфизма (SNP).
4.9. Поиск структурных вариаций: протяженных вставок, делеций, инверсий и транслокаций.
4.10. Аннотация обнаруженных вариаций с использованием баз данных.
4.11. Предсказание функциональных и клинически значимых изменений белка на основе обнаруженных мутаций.
Список литературы.
ГЛАВА 5. Оборудование и программные решения для обработки данных NGS.
5.1. Локальные центры обработки данных NGS: архитектура и программные решения.
5.2. Программное обеспечение для локального центра обработки данных NGS.
5.3. Сетевые сервисы и простые решения для обработки данных NGS.
5.4. Специализированные проекты по обработке данных NGS.
Список литературы.
ГЛАВА 6. Планирование эксперимента с использованием NGS.
6.1. Общие принципы планирования биологических экспериментов.
6.2. Рандомизация в NGS.
6.3. Повторности в NGS.
6.4. Основные типы ошибок при секвенировании.
6.5. Варианты применения NGS.
Список литературы.
ГЛАВА 7. Секвенирование индивидуальных геномов и транскриптомов прокариот.
7.1. Роль NGS в микробиологии.
7.2. История секвенирования бактериальных геномов.
7.3. Определение полной последовательности бактериального генома de novo.
7.4. Пример протокола секвенирования образца бактериальной ДНК.
7.5. Анализ данных геномного секвенирования бактерий.
7.6. Секвенирование транскриптома прокариот.
Список литературы.
ГЛАВА 8. Исследование микробных сообществ методами NGS.
8.1. Очистка ДНК для метагеномных исследований.
8.2. Анализ микробного сообщества секвенированием ампликонов.
8.3. Метагеномное секвенирование.
8.4. Биоинформатический анализ данных метагеномного секвенирования.
8.5. Комбинированный алгоритм анализа таксономического состава сообщества.
8.6. Сравнение метагеномов между собой.
8.7. Метатранскриптом.
Список литературы.
ГЛАВА 9. Секвенирование геномов эукариот.
9.1. Общие аспекты секвенирования сложных геномов.
9.2. Секвенирование эукариотических геномов de novo.
9.3. Повторное секвенирование (ресеквенирование).
9.4. Фазирование при ресеквенировании диплоидных геномов.
9.5. Секвенирование генома отдельной клетки.
Список литературы.
ГЛАВА 10. Секвенирование транскриптомов эукариот.
10.1. Применение NGS для исследования РНК.
10.2. Общие моменты очистки РНК и синтеза кДНК.
10.3. Ферменты для обратной транскрипции.
10.4. Подготовка библиотеки кДНК для NGS.
Список литературы.
ГЛАВА 11. Повышение концентрации определенных последовательностей в библиотеке для NGS (таргетное секвенирование).
11.1. Параметры методов целевого обогащения.
11.2. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК только на основе ПЦР.
11.3. Обогащение библиотеки фрагментов ДНК при помощи гибридизации с пробой.
11.4. Обогащение при помощи гибридизации в растворе с отбором методом ПЦР (инвертированные молекулярные пробы).
11.5. Обогащение библиотеки белок-связывающими последовательностями хроматина (ChIP-Seq).
Список литературы.
ГЛАВА 12. Применение высокопроизводительного секвенирования в медицинской практике.
12.1. Генетическое тестирование с использованием NGS.
12.2. Исследование патогенов и микробиома человека.
Список литературы.
ГЛАВА 13. Перспективы высокопроизводительного секвенирования.
Список литературы.
Предметный указатель.

Купить .





Теги: учебник по медицине :: медицина :: Ребриков :: Коростин :: Шубина :: Ильинский :: секвенирование :: геном